PCR反應假陰性結(jié)果分析研究

PCR反應假陰性不出現(xiàn)擴增條帶的情況通常由以下原因造成：PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量， ④PCR循環(huán)條件。針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。

一、模板：

①模板中含有雜蛋白質(zhì)，

②模板中含有Taq酶抑制劑，

③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，

④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。

⑤模板核酸變性不徹di。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。
二、引物：

引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：

①選定一個好的引物合成單位。

②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。

③引物使用過程中應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效。

④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
三、反應體積的改變：

通常進行PCR擴增采用的體積為20μl、30μl、50μl或100μl，應用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μl后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，否則容易失敗。
四、物理原因：

溫度對PCR擴增來說相當重要。如果變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可導致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下PCR儀或水浴鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

五、靶序列變異：

如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。