PCR實驗中內(nèi)參基因的作用

  在分子生物學(xué)研究中，PCR技術(shù)是檢測和定量基因表達的重要手段。而內(nèi)參基因，作為PCR實驗中的一個關(guān)鍵因素，其作用遠不止是對照那么簡單。本文將詳細探討內(nèi)參基因在PCR實驗中的多重作用。 在PCR實驗中，內(nèi)參基因（又稱管家基因）的作用是校正和標(biāo)準(zhǔn)化樣本，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

具體來說，內(nèi)參基因的作用包括：

1. 判斷樣品提取是否成功：通過檢測內(nèi)參基因的CT值，可以判斷總RNA提取是否成功。如果內(nèi)參基因的CT值在一個合理范圍內(nèi)（如20左右），說明樣品制備沒有問題。

2. 計算目的基因的表達量：在相對定量PCR中，每個樣品的提取效率可能不同，直接比較CT值沒有意義。內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達用來校正這些差異，通過目的基因與內(nèi)參基因的CT值差值（△CT）來計算目的基因的相對表達量。

3. 校正上樣量和實驗誤差：內(nèi)參基因幫助校正由于樣本上樣量不一致或?qū)嶒灢僮髦械恼`差，確保不同樣本之間的比較是公平的。

4. 與熔解曲線對照：如果qPCR的熔解曲線顯示非特異性擴增，可以通過內(nèi)參基因的CT值來判斷是否因為模板濃度過低導(dǎo)致。

5. 標(biāo)準(zhǔn)化目的基因表達量：通過內(nèi)參基因，可以將目的基因的表達量標(biāo)準(zhǔn)化，得到一個相對的表達量值，便于不同樣本之間的比較。

選擇合適的內(nèi)參基因?qū)τ趯嶒灲Y(jié)果至關(guān)重要，理想的內(nèi)參基因應(yīng)滿足以下條件：

1．不受實驗處理方法影響

2．高度或中度表達

3．在不同組織和細胞中穩(wěn)定表達

4．表達水平與細胞周期和細胞活化無關(guān)

5．不位于X染色體上

6．不存在假基因

   常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin、18sRNA、28sRNA等。在選擇內(nèi)參基因時，應(yīng)考慮實驗的具體條件和樣本類型，必要時可以使用多個內(nèi)參進行驗證，或者利用數(shù)據(jù)庫如ICG來獲取合適的內(nèi)參基因信息。