ELISA實驗假假陽性結果分析

 ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫酶技術。ELISA被廣泛應用于農業、養殖業、食品安全等領域，是一種靈敏度高、特異性強、操作簡便的檢測方法。在實際應用中，ELISA操作的各個方面均對結果產生影響，如移液器的使用、樣本存放、加樣、溶血、試劑溫度等。除此之外，一些非主觀因素也會對結果造成較大的偏差。

ELISA實驗假假陽性結果分析：

一、內源性因素

1、年齡因素

老年人容易出現免疫功能異常，產生一些異常蛋白質干擾了檢測的結果出現假陽性。

2、疾病因素

類風濕關節炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內含有嗜異性抗體，自身抗體、類風濕因子等，這些特殊成分在反應過程中有一定的吸附作用，多為體內某些抗原物質干擾所致產生假的顯色反應而出現假陽性。

二、標本因素

1、標本處理不徹底

血液抽出后未完全凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原完全析出，加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物，造成洗板不徹底干凈，酶殘留在反應孔中，使反應孔吸光度值偏高，出現假陽性，待測血清中混有纖維蛋白原，這種物質易沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈，試驗表明在較高的離心轉速（3000/min）和較長的離心時間（>10/min）之上，血液標本被充分地離心分離后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時避免加入這兩種干擾物質對試驗結果的影響。

2、標本溶血

標本溶血時細胞內液的各種活性酶以及具有酶活性的物質與底物非特異性結合，洗滌時不易洗去，催化底物產生一定的顯色反應，使本底吸光度值偏高形成假陽性。

3、細菌污染

標本放置、處置不當被細菌污染，一些細菌體內可能含有內源性辣根過氧化物酶會對相應的酶做標記的測定方法產生非特異性干擾，造成弱的假陽性反應。

三、操作因素

1、加 樣

對于間接ELISA標本一般都要進行稀釋，如果加樣不準就會造成誤差，尤其當稀釋倍數大時，很小的誤差，會導致較大的相對誤差，使陰性（或弱陽性）標本呈陽性（或陰性）。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統處理標本，可較好地避免以上誤差。

2、洗 滌

在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復結果的關鍵一步，應引起操作者重視。無論是手工操作還是機器操作，得出不正確的結果常與不正確的洗滌有關，ELISA就是靠洗滌來達到分離游離和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。

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3、溫 育

每種試劑都有其最合適的反應模式，其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應時間長，會造成整板本底高，陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發，板上應加蓋。

四、儀器因素

1、酶標儀

作為記錄測定結果的儀器，酶標儀的性能穩定與否，決定結果的可靠度。首先酶標儀應定期進行保養，對濾光片要定期校正；其次酶標儀波長設置要正確，最好使用雙波長，一個檢測波長，一個參比波長，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標儀讀數時最好先擦拭微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書

2、波長選擇

酶標儀的波長選擇，建議酶標儀比色時選擇雙波長，即敏感波長（主波長）和非敏感干擾波長（次波長），最后從儀器上得到的讀數為敏感波長與非敏感干擾波長之差，排除（板孔的劃痕、污跡）干擾。

五、方法學因素

1、試劑盒選擇

由于不同廠家的試劑盒所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致，造成靈敏度和特異性不同，因此也造成了假陽性或假陰性的產生。實驗中，不同廠家的ELISA試劑盒不要混用。

2、實驗灰區

在陽性與陰性之間有一條明顯的分界線，作為陽性判定值（cut-off）來判定結果，一般把檢測值S/COV值（樣本吸光度值比臨界值）在0.6-1范圍內時作為灰區帶，因此當1＜S /CO≤0.6時，真反應性顯色的可能性小，多為體內某些抗原物質干擾所致，實驗室檢測人員應依據實驗檢測結果，結合受檢者相應病史和個體狀況進行綜合分析，應進行確認實驗，避免判定假陽性。

3、鉤狀效應

鉤狀效應即HOOK效應,是指由于抗原抗體比例不合適而導致假陰性的現象，其中抗體過量叫做前帶效應；抗原過量叫做后帶效應。鉤狀效應的產生，需對標本進行稀釋重復檢測。

多種因素可能會導致ELISA法本底偏高。出現灰值，除了嚴格操作、做好質控，對可疑假陽性的標本一定要認真復測外。選擇有品牌知名度(國際高影響因子雜志文章使用)，有質量保障(嚴格質量品控)、有優質的售后服務(專業技術服務團隊)、高性價比(國際品質&特惠價格) 的ELISA試劑盒來避免假陽性結果的出現。