PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物詳述

PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上。PCR的原理在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用于擴(kuò)增一小段已知的DNA片段，可能是單個(gè)基因，或者僅僅是某個(gè)基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR只能復(fù)制很短的DNA片段，通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子，因此用互補(bǔ)DNA雙鏈的構(gòu)造單位（核苷酸）來度量其大小，單位為堿基對（base pair, bp）。

下面詳述PCR設(shè)計(jì)引物：

一、PCR設(shè)計(jì)引物前應(yīng)的準(zhǔn)備工作：
1．準(zhǔn)備載體圖譜，大致準(zhǔn)備把片斷插在那個(gè)部分
2．對片斷進(jìn)行酶切分析，確定一下那些酶切位點(diǎn)不能用
3．準(zhǔn)備一本所買公司的酶的商品目錄，便于查酶的各種數(shù)據(jù)及兩種酶是否可以配用

二、引物的結(jié)構(gòu)：
5’—保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+引物配對區(qū)—3’
1．兩個(gè)酶切位點(diǎn)
2．酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基
3．5’端保護(hù)堿基
4．3’端保護(hù)堿基
5．引物配對區(qū)

三、PCR引物設(shè)計(jì)原則：
引物設(shè)計(jì)有3 條基本原則：
首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)；
其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；
再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。
PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。

1. 引物設(shè)計(jì)基本原則
1）、引物長度：18-26bp，可放寬至18-30bp（有研究表明超過30bp再增加引物長度意義不大）；
2）、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3）、引物Tm：54-58℃，可放寬至52～62℃，GC%>60%可進(jìn)一步放寬；
4）、擴(kuò)增子Tm：>92℃；
5）、3'端：優(yōu)選三聯(lián)體WSS、SWS、TTS，二連體GC，單體S，盡量規(guī)避WWW、CGW、GGG、CG；
6）、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；
7）、末端2bp最好為GC；
8）、引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等；
9）、其他：避免3'端8bp及以上序列與模板多位點(diǎn)互補(bǔ)，盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補(bǔ)，盡量避免內(nèi)部回文。

基于上述原則，在實(shí)踐分兩種情況中應(yīng)用：
1、基因克隆PCR引物設(shè)計(jì)
這種情況我們往往并沒有太多選擇，只能從ATG開始，從TAA等結(jié)束，什么GC%、二聚體和錯(cuò)配，可能根本由不得我們。既然起點(diǎn)定了，那只能通過改變長度來匹配最優(yōu)設(shè)計(jì)要求了。
2、鑒定PCR引物設(shè)計(jì)
我們只需要確認(rèn)一段DNA序列上的一部分，起點(diǎn)是相對的，我們可以在整個(gè)序列范圍內(nèi)搜索，引物設(shè)計(jì)的靈活性大大提高，當(dāng)然搜索時(shí)間也要增加。

四、設(shè)計(jì)引物所要考慮的問題
1．酶切位點(diǎn)
兩個(gè)酶切位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個(gè)位點(diǎn)，且距離不能太近，否則往往導(dǎo)致兩個(gè)酶都切不好。因此，兩個(gè)酶切位點(diǎn)要緊挨在一起，只能切一個(gè)，除非恰好是與上面兩個(gè)酶在一起的酶切位點(diǎn)，最好隔四個(gè)核苷酸。且不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的位點(diǎn)比較難切。
2．酶的選擇
最好使用雙酶切效率高的，但兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補(bǔ)），否則效果相當(dāng)于單酶切，最好使用具有共同buffer，且較常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），這樣可以省錢。
3．Tm的計(jì)算
Tm是由互補(bǔ)的DNA區(qū)域決定的，而不互補(bǔ)的區(qū)域?qū)NA的溶解是沒有作用的。因此，對于引物的Tm，只有和模板互補(bǔ)的區(qū)域?qū)m才有貢獻(xiàn)。計(jì)算Tm時(shí)，只計(jì)算互補(bǔ)的區(qū)域（除非你的酶切位點(diǎn)也與模板互補(bǔ)）。設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，先不管5'端的修飾序列，把互補(bǔ)區(qū)的Tm控制在55度以上（我喜歡控制在58以上，具體根據(jù)PCR的具體情況，對于困難的PCR，需要適當(dāng)提高Tm），再加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。
Tm溫度高的引物就比較容易克服3’發(fā)卡、二聚體及3'非特異結(jié)合等問題。簡單的計(jì)算公式可以用2+4的公式。若你計(jì)算的Tm值達(dá)到了快90 ，不包括酶切位點(diǎn)。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點(diǎn)的。自己可以再估計(jì)一下。如你設(shè)計(jì)了帶酶切位點(diǎn)的引物，總長分別為29、33個(gè)堿基，去掉酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，分別為17、21個(gè)堿基。引物公司給的單子是70多度，實(shí)際用的只有50度，用55度擴(kuò)的結(jié)果也差不多。
其它關(guān)于Tm值的計(jì)算，有用PP5.0進(jìn)行評價(jià)的，需要考慮base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer等參數(shù)。
4．退火溫度
退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計(jì)算可以不把加入的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基考慮進(jìn)去， PCR幾個(gè)循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴(kuò)增片斷中，所以你可以在預(yù)變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的Primer計(jì)算出來的。
5．5’端保護(hù)堿基
一般在5'端加保護(hù)堿基,如果你擴(kuò)增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時(shí)可以不需加保護(hù)堿基
6．引物二聚體
關(guān)于引物二聚體，最好用primer或是其他設(shè)計(jì)引物的軟件進(jìn)行計(jì)算一下，看看引物之間的△G（自由能）的絕對值，如果小于10，一般是問題的。如果稍大，PCR時(shí)可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對值較大，如果 PCR沒有條帶，建議重新設(shè)計(jì)引物。此外，所加的三個(gè)核苷酸的保護(hù)序列經(jīng)過盡心設(shè)計(jì)有時(shí)也可以降低二聚體的△G。
7．引物的設(shè)計(jì)
在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因?yàn)椋粋€(gè)特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基，大致就是28bp左右了。而我們在設(shè)計(jì)退火溫度時(shí)，與引物的長度有關(guān)，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。
還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設(shè)計(jì)一個(gè)酶位點(diǎn)時(shí)，最好把該酶的性質(zhì)弄清楚。設(shè)計(jì)時(shí)限制性酶切位點(diǎn)是應(yīng)該在5’端的頂端。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，常在5’端添加酶切位點(diǎn)，以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。
設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。先用軟件設(shè)計(jì)出合適的引物，引物的3’端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板準(zhǔn)確配對，應(yīng)盡量避免在引物3’端的第一位堿基是A（容易錯(cuò)配）。引物3’端最佳堿基的選擇是G和C，因?yàn)樗麄冃纬傻膲A基配對比較穩(wěn)定，目的序列上并不存在的。